INTRODUCCION

ELISA-DAS (Sándwich de doble anticuerpo) es una prueba inmunoenzimática que usa las placas de microtitulación como soporte para las muestras y reactivos empleados.

El procedimiento para la detección de Ralstonia solanacearum (Rs) en tallos de plantas de papa asintomaticas, resumido en la Figura N^o 1, consiste en:

• Cubrir los hoyos de la placa de microtitulación con inmunoglobulinas (IgG) de conejo específicas de Rs
• Agregar las soluciones preparadas a partir de las muestras de tallos en los hoyos de la placa de microtitulación
• Añadir las inmunoglobulinas de conejo específicas de Rs conjugadas con fosfatasa alcalina (IgG conjugadas)
• Añadir la enzima sustrato; si Rs está presente en el extracto de tallo se producirá una reacción de coloración, la intensidad de ésta será proporcional a la concentración de bacterias.

La bacteria puede estar presente en los tallos de plantas asintomáticas de papa en bajas concentraciones, por lo que antes de realizar la prueba ELISA-DAS se debe seguir un proceso de enriquecimiento que permita que la bacteria se multiplique a niveles detectables. Esto se hace incubando el extracto de tallo en un caldo de enriquecimiento a 30^oC durante 48 horas con agitación constante. Por este procedimiento, el método es capaz de detectar concentraciones tan bajas como 20 células bacterianas por ml de extracto (en comparación con 10⁶ células / ml que se detectan sin enriquecimiento).

Las inmunoglobulinas específicas de Rs que vienen en el kit hacen posible la detección de cualquier tipo de raza, biovar o serotipo de Rs. Algunas bacterias saprofitas tienen reacción cruzada con los anticuerpos producidos contra Rs en cultivos puros a concentraciones iguales o mayores a 10⁸ celulas / ml. Sin embargo, no se han detectado reacciones cruzadas en DAS-ELISA, después del enriquecimiento de los extractos de tallo que contienen bacterias saprofitas y endofitas que se encuentran en los haces vasculares del tallo.

Este kit puede utilizarse para el monitoreo de Rs en tallo dos a cuatro semanas antes de la cosecha, proceso esencial para los esquemas de certificación de papa, así como para la detección en tubérculos y en las raíces de papa u otros hospedantes, para estudiar la epidemiología de la enfermedad.

Toma y tamaño de muestras de tallo

Para análisis de un lote de semilla básica

• Un lote de semilla = Tallos cosechados del mismo campo, de la misma variedad de papa proveniente del mismo lote de semilla.
• Se recomienda analizar 400 tallos por lote de semilla proveniente de un campo de 0.5 a 2 hectáreas de papa. Las plantas se deben tomar al azar siguiendo una ruta en zigzag en el campo.
• Cortar con una tijera de podar un fragmento de tallo de aproximadamente 10 cm de longitud de la parte basal de la planta sobre el nivel del suelo. Colectar uno de los tallos principales de cada una de las 400 plantas.
• Desinfectar la tijera de podar entre cada muestra compuesta de 25 fragmentos de tallo con una solución de hipoclorito de sodio al 1 % de producto activo.
• Envolver cada muestra compuesta en papel toalla y poner dentro de una bolsa de papel.
• Analizar la muestra el mismo día o conservarlas un día como máximo en un lugar fresco (alrededor de 15°C) pero no en la refrigeradora.
  

Para análisis de semilla prebásica

• Analizar 0.5 % de plantas de la misma variedad, del mismo invernadero y del mismo lote de multiplicación.
• Cada muestra esta compuesta de 10 fragmentos de tallo.
• Analizar la muestra el mismo día o conservarlas un día como máximo en un lugar fresco (alrededor de 15°C) pero no en la refrigeradora.

Por ejemplo en el caso de 25 clones, 100 plantas por clon pueden ser analizadas mezclando 10 fragmentos de tallo como una sola muestra compuesta; por lo tanto analizaremos 10 muestra compuestas. En este caso un kit es suficiente para analizar 25 clones con 100 plantas cada uno (un total de 250 muestras compuestas). Si una sola muestra resulta positiva, todo el lote será descartado.