Manual y video

Introducción

ELISA-NCM (prueba inmunoenzimática en membrana nitrocelulosa) es una prueba inmunoenzimática para la que se usan membranas de nitrocelulosa en lugar de placas de microtitulación como soporte para las muestras y reactivos empleados. Luego del enriquecimiento, ELISA-NCM es tan sensible como DAS-ELISA (Double-Antibody Sandwich), así como más fácil y rápido de usar. Tiene otra ventaja importante: la membrana de nitrocelulosa procesada con las muestras puede almacenarse durante varias semanas antes de realizar la prueba. Por consiguiente, se pueden enviar membranas a otro laboratorio para efectuar este ensayo.

La prueba consiste en:

1. Colocar una pequeña cantidad de extracto del tubérculo (20 µl) sobre la membrana de nitrocelulosa (dot-blotting);
2. Bloquear el área de la membrana donde no están colocadas las muestras (1 hora de incubación);
3. Añadir los anticuerpos de conejo específicos de Ralstonia solanacearum (Rs) (2 horas de incubación);
4. Añadir los anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados (=GAR-IgG conjugado) (1 hora de incubación); y
5. Añadir el sustrato que reacciona con las enzimas y produce una reacción de coloración (de 5 a 20 minutos).

Todos estos pasos se realizan a temperatura ambiental. Una coloración morada revela la presencia de Rs en las muestras. La intensidad de la coloración es proporcional a la concentración de bacterias. Luego de efectuar la prueba ELISA, la membrana estará estable y podrá almacenarse durante un largo periodo de tiempo.

Antes de realizar la prueba ELISA-NCM, se debe seguir un proceso de enriquecimiento incubando los extractos del tubérculo en un caldo semi-selectivo (SMSA modificado, Figura 1). Este proceso aumenta la sensibilidad del método casi 1 millón de veces. De esta manera se pueden detectar hasta 10 bacterias por ml del extracto del tubérculo en comparación con 10⁶ - 10⁷ bact/ml que se detectan sin enriquecimiento. Esto permite la detección de Rs en tubérculos de papa (o tallos) con infección latente, es decir, que no presentan síntomas visibles.

Los anticuerpos específicos de Rs que vienen en el kit hacen posible la detección de cualquier tipo de raza, biovar o serotipo de Rs. Algunas bacterias saprofitas, en cultivos puros a concentraciones iguales o mayores a 10⁸ bact./ml, inducen reacción cruzada con los anticuerpos producidos contra Rs. Por lo que, cuando se usa el kit con fines de diagnóstico (es decir para confirmar que las bacterias aisladas son Rs) la concentración de las bacterias sospechosas en la suspensión acuosa debe ser 10⁷ bact./ml. A esta concentración, Rs produce una reacción positiva en ELISA pero los saprofitos no. Sin embargo, no se ha detectado ninguna reacción cruzada después del enriquecimiento del extracto preparado a partir de los haces vasculares del tubérculo.

Este kit puede utilizarse para el monitoreo de Rs en tubérculos de papa, proceso esencial para los esquemas de certificación de semilla  y evaluación varietal para la resistencia a la marchitez bacteriana. También se puede aplicar para el monitoreo en tallos de papa y en otras plantas para investigaciones sobre epidemiología de la enfermedad (supervivencia y diseminación de Rs). Para detectar Rs en raíces de planta es preferible usar ELISA-DAS porque la coloración marrón oscura de los extractos de raíces impide la lectura de la reacción ELISA en la membrana.

Número DE MUESTRAS A SER ANALIZADAS EN ELISA-NCM PARA LA Detección DE RALSTONIA SOLANACEARUM EN Tubérculos CON INFECCIÓN LATENTE

Para el análisis de un lote de semilla básica

Cada muestra procede de una mezcla de los fragmentos de 25 tubérculos.

Un lote de semilla = los tubérculos cosechados de un mismo campo, de la misma variedad de papa proveniente del mismo lote de semilla.

Se recomienda analizar 400 tubérculos por lote de semilla proveniente de un campo de 0.5 a 2 hectáreas de papa. 

• Tomar los tubérculos al azar de los montones o de los surcos a la cosecha, o de los almacenes al inicio del periodo de almacenamiento. Si se tienen que tomar las muestras antes de la cosecha  (preferiblemente no más de dos semanas antes de la cosecha), seleccionar al azar las plantas en el campo y tomar al azar dos tubérculos por planta.
• Dividir estos 400 tubérculos en 16 submuestras de 25 tubérculos cada una. Macerar los fragmentos tomados de los 25 tubérculos en una sola bolsa y por cada bolsa tomar dos alícuotas de 500 ml (0.5 ml) del extracto de tubérculos y mezclar cada una con el mismo volumen de caldo SMSA para la etapa de enriquecimiento (incubación durante 48 h a 30°C).
• Para el análisis en ELISA-NCM, cada una de estas 32 muestras enriquecidas será colocada sobre la membrana (los duplicados son necesarios sólo cuando la colocación no fue satisfactoria).

Un kit es suficiente para analizar 18 lotes de semilla.

Importante: En el caso del análisis de semilla para comercio internacional o litigio, confirmar los resultados positivos obtenidos en ELISA mediante (i) aislamiento de R. solanacearum en medio Kelman ó SMSA a partir de los extractos de tubérculo enriquecidos e (ii) inoculación de plantas de tomate con los aislamientos obtenidos para confirmar su patogenicidad.

Para el análisis de semilla prebásica

Cada muestra procede de una mezcla de los fragmentos de dos tubérculos.

• Analizar 0.5% de plantas de la misma variedad, del mismo invernadero y del mismo lote de multiplicación.
• Tomar al azar dos tubérculos por planta para procesarlos juntos como una sola muestra. Mezclar una alícuota de 500 ml (0.5 ml) del extracto de tubérculos con el mismo volumen de caldo SMSA para la etapa de enriquecimiento.

Por ejemplo, en un lote de 5000 plantas, se analizarán 25 muestras de dos tubérculos (total 50 tubérculos). En este caso, un kit es suficiente para analizar 23 lotes de semilla prebásica.

Para la evaluación del germoplasma

Cada muestra procede de los fragmentos de un solo tubérculo.

El propósito es evaluar la infección latente en los tubérculos de clones que no muestran marchitez visible en el campo, o hacer una comparación cuantitativa del nivel de infección latente en clones o variedades.

• Por cada clon, analizar 30 tubérculos que serán procesados individualmente. Seleccionar 30 tubérculos (de cualquier tamaño por encima de 30 mm) al azar en las parcelas experimentales o tomar al azar de 15 plantas dos tubérculos por planta.
• Procesar por separado los tubérculos y mezclar una alícuota de 500 ml (0.5 ml) del extracto de tubérculos con el mismo volumen de caldo SMSA para la etapa de enriquecimiento.
• Convertir el numero (n) de tubérculos infectados (ELISA positivo) en un porcentaje por clon (n/30 x 100).

Un kit es suficiente para analizar 19 clones o variedades de papa.