INTRODUCCION

ELISA-DAS (Sándwich de doble anticuerpo) es una prueba inmunoenzimática que usa las placas de microtitulación como soporte para las muestras y reactivos empleados.

El procedimiento para la detección de Ralstonia solanacearum en el suelo, consiste en:

1. Cubrir los hoyos de la placa de microtitulación con inmunoglobulinas (IgG) de conejo específicas de Ralstonia solanacearum (Rs)
2. Agregar las soluciones preparadas a partir de las muestras de suelo en los hoyos de la placa de microtitulación
3. Añadir las inmunoglobulinas de conejo específicas de Rs conjugadas con fosfatasa alcalina (IgG conjugados)
4. Añadir la enzima sustrato; si Rs está presente en la solución del suelo se producirá una reacción de coloración, la intensidad de ésta será proporcional a la concentración de bacterias

La bacteria puede estar presente en el suelo en bajas concentraciones, por lo que antes de realizar la prueba ELISA-DAS se debe seguir un proceso de enriquecimiento que permita que la bacteria se multiplique a niveles detectables. Esto se hace incubando la solución del suelo en un caldo de enriquecimiento a 30oC durante 48 horas con agitación constante. Por este procedimiento, el método es capaz de detectar concentraciones tan bajas como 20 células bacterianas por gramo de suelo (en comparación con 10⁷ bacterias/gramo que se detectan sin enriquecimiento).

Las inmunoglobulinas específicas de Rs que vienen en el kit hacen posible la detección de cualquier tipo de raza, biovar o serotipo de Rs. Algunas bacterias saprofitas tienen reacción cruzada con los anticuerpos producidos contra Rs en cultivos puros a concentraciones iguales o mayores a 10⁸ bact/ml. Sin embargo, no se han detectado reacciones cruzadas en DAS-ELISA, después del enriquecimiento de las soluciones del suelo que contienen estas bacterias saprofitas.

Este kit puede utilizarse para el monitoreo de Rs en suelo después de la cosecha, así como en la rizósfera, el rizoplano y las raíces de papa u otros hospedantes, para estudiar la epidemiología de la enfermedad,  evaluar la efectividad de un método de control en reducir la población del patógeno y determinar  si un campo es apropiado para la producción de semilla.

Protocolo de toma de muestra

En campos con cultivos de papa o de otros hospedantes, tomar las muestras en la rizósfera de las plantas. En campos ya cosechados se recomienda una profundidad de muestreo de aproximadamente 20 a 30 cm para evitar áreas de alta fluctuación de humedad y temperatura que puedan influir en las poblaciones bacterianas. El suelo debe estar en su capacidad de campo. Colectar aproximadamente 100 g de suelo por muestra con una lampita de mano. Desinfectar la lampita con hipoclorito de sodio al 0.5% y enjuagar con agua después de cada muestra.

Colectar las muestras en bolsas de polietileno, las que se mantienen abiertas durante el muestreo. Transportar las muestras al laboratorio bajo condiciones que eviten exceso de calor. En el laboratorio abrir  las bolsas inmediatamente y almacenarlas en un lugar ventilado para evitar la multiplicación de bacterias antagonistas y anaeróbicas. Es preferible procesar las muestras de inmediato. Si no, conservar las muestras a lo máximo por una semana en almacenaje frío (temperatura entre 10 y 15ºC). Mantener  la humedad de las muestras del suelo en su capacidad de campo.

Tamaño de la muestra

Campo experimental

Para evaluar los métodos de control de la marchitez bacteriana en parcelas experimentales de 15-20 m² en un suelo altamente infestado con Rs, tomar una muestra de suelo de aproximadamente 100 g de cada 2 m². Mezclar bien todas las muestras, luego tomar dos muestras compuestas de 100 g de suelo de cada parcela.

Para una semicuantificación de la población de la bacteria en el suelo, hacer diluciones seriadas a partir del sobrenadante de la solución de suelo en tampón citrato hasta 10^-5 (10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 y 10^-5). Estas diluciones deben ser enriquecidas mezclando 1 ml de cada dilución con 9 ml del caldo de enriquecimiento e incubando a 30ºC durante dos días en agitación constante.

El kit es suficiente para dos evaluaciones de un campo experimental de 12 parcelas de aproximadamente 15-20 m²  cada una.

Campo de producción de semilla

Para la evaluación cualitativa del inóculo del suelo (presencia o ausencia de Rs), analizar 20 muestras compuestas por hectárea. Cada muestra esta compuesta por la mezcla de cinco sub-muestras. Las muestras se deben tomar al azar siguiendo una ruta en zigzag o aspa. Por cada muestra hacer dos diluciones seriadas (10^-1 y 10^-2) a partir del sobrenadante de la solución de suelo en tampón de citrato. Estas diluciones deben ser enriquecidas mezclando 1 ml de cada dilución con 9 ml de caldo de enriquecimiento e incubando a 30ºC durante dos días en agitación constante.

El kit es suficiente para evaluar cinco campos de aproximadamente 1 ha cada uno.