INTRODUCCION

ELISA-DAS (Sándwich de doble anticuerpo) es una prueba inmunoenzimática que usa las placas de micro titulación como soporte para las muestras y reactivos empleados.

El procedimiento para la detección de Ralstonia solanacearum en agua de riego, resumido en la Figura N^o 1, consiste en:

• Cubrir los hoyos de la placa de microtitulación con inmunoglobulinas (IgG) de conejo específicas de Ralstonia solanacearum (Rs);
• Agregar las soluciones preparadas a partir de las muestras de agua en los hoyos de la placa de microtitulación;
• Añadir las inmunoglobulinas de conejo específicas de Rs conjugadas con fosfatasa alcalina (IgG conjugadas);
• Añadir la enzima sustrato; si Rs está presente en la muestra de agua se producirá una reacción de coloración, la intensidad de ésta será proporcional a la concentración de bacterias.

La bacteria puede estar presente en el agua en bajas concentraciones, por lo que antes de realizar la prueba ELISA-DAS se debe seguir un proceso de enriquecimiento que permita que la bacteria se multiplique a niveles detectables. Esto se hace incubando la muestra de agua en un caldo de enriquecimiento a 30^oC durante 48 horas con agitación constante. Por este procedimiento, el método es capaz de detectar concentraciones tan bajas como 10 células bacterianas por ml de agua (en comparación con 10⁵ bacterias/ml que se detectan sin enriquecimiento).

Las inmunoglobulinas específicas de Rs que vienen en el kit hacen posible la detección de cualquier tipo de raza, biovar o serotipo de Rs. Algunas bacterias saprófitas tienen reacción cruzada con los anticuerpos producidos contra Rs en cultivos puros a concentraciones iguales o mayores a 10⁸ bact/ml. Sin embargo, no se han detectado reacciones cruzadas en DAS-ELISA, después del enriquecimiento de las muestras de agua que contienen estas bacterias saprofitas.

Este kit puede utilizarse para el monitoreo de Rs en agua de riego, para estudiar la epidemiología de la enfermedad y determinar las posibles fuentes de contaminación.

Toma y tamaño de muestra de agua

• Por cada canal de riego, tomar 3 muestras de agua de 150 ml cada una del canal principal y lo mas cerca posible del campo de papa regado.
• Tomar la muestra a una profundidad de 10 cm debajo de la superficie del agua, y a 20 cm de distancia de la orilla.

Guardar la muestra máximo durante un día a medio ambiente y en un lugar fresco (aprox. 15°C) y agitar de vez en cuando (no guardar en la refrigeradora).